Основна експозиція музею відкривається залою українського сакрального мистецтва XVIII – початку XIX століття, яку як повноцінну частину постійної експозиції почали демонструвати лише з другої половини 1980-х років. Сучасного вигляду зала набула влітку 2021 року з акцентом на мистецтві Придніпров’я. Основу колекції становлять пам’ятки зі зібрання Д.І. Яворницького, зокрема ікони «Богоматір “Нев’янучий Цвіт”», «Христос “Цар Небесний”», «Іоанн Богослов», що походять з іконостаса Свято-Миколаївського собору села Куцеволівка та є зразками українського бароко. В експозиції представлені також різьблені оздоби і твори майстра Сисоя Шалматова, стародруки й сакральні атрибути. Перлиною збірки є вінчальна пара — «Христос Вседержитель» і «Богоматір з немовлям», написані козацьким богомазом та оздоблені характерним квітковим орнаментом Придніпров’я.
Музейна колекція українських портретів XVII – початку XIX століття представлена переважно творами придніпровського походження. Значну частину з них музей отримав завдяки діяльності Дмитра Яворницького, який залучив портрети з приватних зібрань місцевих колекціонерів і козацько-старшинських родин. В експозиції демонструються вісім портретів безіменних українських майстрів. Серед них — ктиторські та епітафіальні зображення, зокрема «Портрет гетьмана Івана Мазепи», «Портрет сотника Василя Родзянка» та «Портрет єпископа Йоасафа». Для цих творів характерні урочистість, парадні костюми та меморіальний зміст. Поряд із ними представлені світські та «статусні» портрети гетьманів Івана Скоропадського й Івана Самойловича. Особливе місце посідає «Портрет Павла Руденка» роботи Володимира Боровиковського, що поєднує традиції українського та західноєвропейського живопису.